DAP-seq技術(shù)助力揭示擬南芥根基本組織發(fā)育的調(diào)控機(jī)制

2024 年 11月 18 日，蘭州大學(xué)黎家教授團(tuán)隊(duì)在《Current Biology》（IF=8.1）發(fā)表了題為“Three RLKs integrate SHR-SCR and gibberellins to regulate root ground tissue patterning in Arabidopsis thaliana"的研究論文，該研究揭示了受體激酶ARH1、FEI1和FEI2共同調(diào)控根基本組織發(fā)育的分子機(jī)制，并借助DAP-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)SHR和SCR可能通過(guò)與其他調(diào)節(jié)蛋白的相互作用來(lái)抑制這些RLK的表達(dá)。

研究背景

在擬南芥中，根部早期發(fā)育階段的基質(zhì)（GT）由皮層和內(nèi)皮層組成。在基質(zhì)成熟過(guò)程中，內(nèi)皮層偶爾會(huì)發(fā)生額外的周緣細(xì)胞分裂（PCDs），在皮層和內(nèi)皮層之間形成中間皮層（MC）。已鑒定出多種調(diào)節(jié)蛋白和植物激素參與基質(zhì)模式的形成，如SHORT ROOT（SHR）、SCARECROW（SCR）、CYCLIND6；1（CYCD6；1）和赤霉素（GAs）。受體樣激酶（RLKs）家族（如LRR-RLKs）在根發(fā)育中的作用也逐漸被關(guān)注，但這些因素之間的相互關(guān)系尚未闡明。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

本研究通過(guò)遺傳篩選尋找影響皮層組織模式的突變體，并結(jié)合分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生化方法驗(yàn)證候選基因功能，發(fā)現(xiàn)ARH1、FEI1和FEI2在調(diào)控?cái)M南芥根尖的GT模式中起著關(guān)鍵作用。

圖1 ARH1、FEI1和FEI2的三重突變體在根尖內(nèi)皮組織中表現(xiàn)出增強(qiáng)的PCD。

圖2 三重突變體根尖的附加細(xì)胞層表現(xiàn)出MC的細(xì)胞特征。

圖3 ARH1、FEI1和FEI2主要以細(xì)胞自主的方式調(diào)節(jié)MC的形成。

研究顯示ARH1、FEI1和FEI2的轉(zhuǎn)錄水平受到SHR和SCR的負(fù)調(diào)控。作者通過(guò)BiFC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SHR和SCR并不是通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用直接調(diào)節(jié)RLKs的功能。隨后為進(jìn)一步研究了這些RLKs的轉(zhuǎn)錄水平是否受SHR和SCR的直接調(diào)控，作者使用了Chip-seq和DAP-seq技術(shù)檢測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子和DNA序列之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些RLKs的啟動(dòng)子和兩種轉(zhuǎn)錄因子之間不存在相互作用。同時(shí)采用酵母單雜交系統(tǒng)和熒光素酶(LUC)報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證，也未能檢測(cè)到三個(gè)RLKs的啟動(dòng)子和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。這些結(jié)果表明，SHR和SCR可能通過(guò)一種間接的機(jī)制負(fù)調(diào)控三個(gè)RLKs的轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 SHR和SCR負(fù)調(diào)控ARH1、FEI1和FEI2的轉(zhuǎn)錄水平。

圖S5 使用四種不同的方法檢測(cè)SHR/SCR與ARH1、FEI1和FEI2啟動(dòng)子之間的潛在相互作用。

為了進(jìn)一步理解ARH1、FEI1和FEI2調(diào)節(jié)GT模式的機(jī)制，作者通過(guò)外源GA和PAC（GA生物合成抑制劑）處理結(jié)合突變體分析，結(jié)果表明RLKs通過(guò)調(diào)節(jié)GAs的合成來(lái)影響根基本組織發(fā)育。同時(shí)通過(guò)共聚焦和RT-qPCR分析根尖CYCD6;1基因的表達(dá)變化，明確了CYCD6;1在根基本組織發(fā)育中的作用。以上結(jié)果，提出并證明了SHR/SCR-ARH1/FEI1/FEI2-GAs-CYCD6;1的根基本組織發(fā)育調(diào)控模塊。即在根發(fā)育早期，受體激酶通過(guò)調(diào)節(jié)GAs的合成抑制CYCD6;1在根尖內(nèi)皮層中的異位表達(dá)，進(jìn)而抑制中皮層形成，精確調(diào)控根基本組織的發(fā)育。

圖5 ARH1、FEI1和FEI2通過(guò)根尖GA的生物合成調(diào)節(jié)GT模式。

圖6 SHR和SCR突變體根尖中催化GA生物合成酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平升高。

圖S6 抑制GA生物合成可部分挽救shr和scr中MC形成減少的表型。

綜上所述，該研究明確了ARH1、FEI1和FEI2三個(gè)受體激酶在整合SHR-SCR信號(hào)通路和GA信號(hào)來(lái)調(diào)控根基本組織模式中的關(guān)鍵作用，揭示了根基本組織發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。