介紹酵母雙雜交的兩種構(gòu)建方法

　　酵母雙雜交技術(shù)作為研究蛋白質(zhì)相互作用的主要方法，在規(guī)模化蛋白質(zhì)相互作用研究中占據(jù)舉足輕重的地位，已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要實(shí)驗(yàn)手段，因此有不少生物公司提供從構(gòu)建雜交文庫(kù)到文庫(kù)篩選的一站式酵母雙雜交服務(wù)。但是酵母雙雜交技術(shù)的分子生物學(xué)操作是比較復(fù)雜的，包含從基因的載體構(gòu)建、蛋白質(zhì)的自激活檢測(cè)到多次酵母轉(zhuǎn)化和相互作用的確認(rèn)，對(duì)酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，可以提高其工作效率。

　　目前市場(chǎng)上提供的酵母雙雜交服務(wù)有核體系和膜體系兩種，酵母雙雜交與其他相互作用篩選手段相比，最大的優(yōu)勢(shì)在于它能夠適應(yīng)基因組水平的高通量篩選。美迪西提供酵母雙雜交服務(wù)，其具有獨(dú)立優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室和專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員，提供詳細(xì)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)步驟、原始數(shù)據(jù)和圖片、結(jié)果分析，可以出具檢測(cè)數(shù)據(jù)報(bào)告。

　　為了降低工作量使其更適用于高通量篩選，需要對(duì)酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，常采用的手段有酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)和規(guī)模化載體構(gòu)建方法。

　　1、酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)

　　從傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的酵母雙雜交文庫(kù)篩選技術(shù)能夠支持一個(gè)誘餌與整個(gè)cDNA文庫(kù)的篩選，可以用于篩選一個(gè)蛋白質(zhì)與整個(gè)cDNA文庫(kù)中的相互作用。但是該技術(shù)并不適用于基因組水平的相互作用篩選。

　　首先，基因組水平的相互作用篩選需要成千上萬(wàn)的誘餌，而對(duì)這些誘餌進(jìn)行文庫(kù)篩選工作量極大；其次，由于cDNA片段不同，篩選過(guò)程中呈劣勢(shì)生長(zhǎng)的菌株不容易得到篩選；最后篩庫(kù)同樣面臨單次篩選只能獲得文庫(kù)中極少部分的相互作用結(jié)果。為了適應(yīng)基因組水平的相互作用篩選，人們開(kāi)發(fā)了酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)。

　　陣列篩選法又可分為一對(duì)一陣列、高通量陣列法、亞庫(kù)對(duì)亞庫(kù)法。一對(duì)一陣列法含有不同BD-X的菌株和所有含不同AD-Y的菌株一一對(duì)應(yīng)篩選。

　　高通量陣列法是把所有不同ORF-AD集合成庫(kù)，然后與排成陣列的不同BD-X作用的篩選方法，其實(shí)質(zhì)是誘餌數(shù)量較大情況下的陣列化文庫(kù)篩選。亞庫(kù)對(duì)亞庫(kù)法把總數(shù)較大的DBD-X和AD-Y的成員分別編號(hào)并分組，每組含一定數(shù)量的成員，然后集合每組成員形成亞庫(kù)(pool)，再用獵物亞庫(kù)對(duì)誘餌亞庫(kù)一一作用，篩選陽(yáng)性克隆。此法工作量大，獲得的陽(yáng)性克隆的獵物和誘餌都需測(cè)序鑒定。

　　2、規(guī)模化載體構(gòu)建方法

　　規(guī)模化酵母雙雜交篩選需要構(gòu)建大量的表達(dá)載體，因此載體構(gòu)建工作的質(zhì)量和速度對(duì)于后續(xù)的酵母雙雜交篩選至關(guān)重要。傳統(tǒng)的構(gòu)建載體的方法是限制酶切-連接方法，可以有效地將目的片段插入載體，然而其操作時(shí)間長(zhǎng)，需要酶切、連接兩步反應(yīng)，構(gòu)建成功后的重組質(zhì)粒需要進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證其正確性，表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中存在載體自連、連接困難等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)使得限制酶切-連接方法不能用于高通量的載體構(gòu)建。