Plant Physiol | DAP-seq助力揭示楊樹根系抗旱新機制

在全球氣候變暖背景下，干旱已成為威脅植物生長的重大挑戰。在植物中，根系是干旱脅迫信號的主要感知器，其發育直接影響抗旱能力。然而，在樹木中不定根（ARs）和側根（LRs）對非生物脅迫的協調反應所依據的理論仍不清晰。

近日，東北林業大學-楊靜莉研究團隊在Plant Physiology（IF=6.5）發表題為PuUBL5-mediated ZINC FINGER PROTEIN 1 stability is critical for root development under drought stress in Populus ussuriensis的研究論文，該研究借助DAP-seq技術揭示了楊樹通過“分子開關"PuZFP1協調側根抑制與不定根伸長的抗旱策略，為抗旱林木的遺傳改良提供了新的理論依據。

技術路線

研究結果

PuZFP1含有典型的C2H2鋅指結構域（氨基酸43-65）和一個C端高度保守的EAR抑制基序（DLSLRL），與擬南芥AtZP1高度同源（結構相似性＞60%），定位在細胞核與細胞質。RT-qPCR和啟動子驅動的GUS染色結果顯示，干旱和ABA處理顯著誘導PuZFP1表達，并且在于根系分化區（DZ）和伸長區（EZ）特異性表達，與側根發生和不定根伸長區域重疊。酵母轉錄激活實驗和Gal4-GUS/LUC系統結果表明，PuZFP1是轉錄抑制因子，并且EAR基序是PuZFP1發揮轉錄抑制功能的必需結構。通過構建PuZFP1過表達（OE）和RNA干擾（RNAi）株系，發現PuZFP1負調控側根（LR）形成，正調控不定根（AR）伸長，在楊樹根系響應干旱脅迫中發揮關鍵調控作用。

圖1. PuZFP1的生物信息學和表達模式分析。

圖2. PuZFP1賦予楊樹抗旱能力。

圖3. PuZFP1賦予楊樹抗旱能力。

進一步研究發現，PuZFP1的穩定性受泛素樣蛋白PuUBL5調控。酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補（BiFC）和Pull-down實驗證實，PuZFP1與PuUBL5直接互作，且PuZFP1通過26S 蛋白酶體途徑降解。蛋白酶體抑制劑MG132處理實驗進一步表明，阻斷蛋白酶體途徑可顯著抑制PuZFP1降解，驗證了該降解機制的依賴性。

圖4. PuZFP1與PuUBL5相互作用，并發生PuUBL5介導的降解。

為確定PuZFP1的靶基因，研究團隊將DAP-seq和RNA-seq聯合分析，鑒定出PuZFP1的下游靶基因PuWRKY46和 PuEGR1。DAP-seq結果顯示，PuZFP1主要結合在轉錄起始位點（TSS）附近，在所有的結合峰中，啟動子區占比19%，基因間區占比65%。雙熒光素酶報告基因實驗表明，PuZFP1對這兩個基因的啟動子具有轉錄抑制作用，同時ABA處理抑制了PuZFP1與靶基因啟動子的結合。

結合EMSA實驗和靶基因功能研究發現PuZFP1通過結合PuWRKY46啟動子中的CAGTG元件抑制其轉錄，進而阻斷側根原基形成；同時，通過抑制PuEGR1（含TTTTGTTT結合基序）的表達，解除對不定根伸長區（EZ）細胞伸長的抑制。

圖5. PuZFP1靶基因的鑒定和直接結合驗證。

圖6. PuWRKY46楊樹抗旱能力。

圖7. PuEGR1賦予楊樹抗旱能力。

結合激素信號分析結果，發現PuZFP1通過協調脫落酸（ABA）與生長素（IAA）信號通路，雙向調控根系發育：在根系分化區（DZ），PuZFP1抑制靶基因PuWRKY46的表達，導致該區ABA含量升高、IAA含量降低，ABA/IAA比例升高，從而抑制側根（LR）原基的形成與萌發；而在伸長區（EZ），PuZFP1抑制PuEGR1的表達，使該區ABA含量降低、IAA含量升高，ABA/IAA比例降低，進而促進不定根（AR）細胞的伸長。這種ABA與生長素的時空比例調控，是PuZFP1介導根系結構適應干旱脅迫的核心機制。

圖8. PuZFP1表達與ABA/auxin途徑聯合調控根系發育。

綜上所述，本研究揭示了PuUBL5-PuZFP1模塊通過ABA /auxin信號調控根系發育的機制，為楊樹抗旱分子育種提供了理論依據。

圖9. 楊樹PuZFP1-PuUBL5模塊響應干旱脅迫下的模型。

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