RNA Pull Down和RIP的技術(shù)應(yīng)用

RNA Pull Down和RIP的技術(shù)應(yīng)用：ELF18誘導(dǎo)的lncRNA ELENA1與MED19a互作增強(qiáng)擬南芥免疫反應(yīng)

植物和動(dòng)物在自然環(huán)境中都面臨著被各種微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)。與動(dòng)物一樣，植物也演化出了一套模式識別受體（PRRs），這些受體能識別整個(gè)微生物病原體類別的分子特征，進(jìn)而啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)。本文鑒定了擬南芥中一種長非編碼RNA（lncRNA）-ELENA1，通過In Vitro RNA Pull-Down、RIP等技術(shù)揭示了ELENA1調(diào)控?cái)M南芥抗病性的機(jī)制。

1、ELENA1通過受體依賴途徑表達(dá)

為探究lncRNA在植物免疫中的調(diào)節(jié)途徑，作者通過T-DNA插入得到敲除突變體efr-2和fls2，使用elf18及flg22處理后，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生型對比受體敲除株efr-2和fls2中的ELENA1被抑制轉(zhuǎn)錄。此外ELENA1啟動(dòng)子-GUS分析證實(shí)其啟動(dòng)子攜帶對elf18和flg22高度響應(yīng)的順式作用元件。以上結(jié)果表明ELENA1轉(zhuǎn)錄是通過受模式識別受體（PRR）依賴途徑調(diào)節(jié)的。

圖1.ELENA1的轉(zhuǎn)錄水平由elf18和flg22誘導(dǎo)

2、ELENA1作為lncRNA正調(diào)控植物抗病性

為了研究ELENA1是作為非編碼RNA還是編碼RNA在植物先天免疫中發(fā)揮功能，作者首先構(gòu)建了兩種不同的突變植物35S:5m_ELENA1（ELENA1_5M）和35S:8m_ELENA1（ELENA1_8M）。分析了四種不同ELENA1表達(dá)水平（1800-3200倍）的過表達(dá)株系，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株中ELENA1的轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)高于PR1表達(dá)的飽和水平，ELENA1的表達(dá)水平不會(huì)顯著影響PR1的表達(dá)水平。同時(shí)使用elf18對ELENA1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行處理，與野生型相比PR1 表達(dá)水平與ELENA1相似均有所增加。

隨后作者通過人工miRNA構(gòu)建了ELENA1過表達(dá)株和敲除株。使用Pst DC3000處理，通過表型觀察，RT-qPCR等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，ELENA1敲除株對Pst DC3000的耐受性更低，而ELENA1過表達(dá)株的耐受性更高。同時(shí)PR1和PR2的表達(dá)情況與ELENA1呈現(xiàn)出相同的趨勢。以上結(jié)果表明ELENA1作為lncRNA正調(diào)控PR相關(guān)基因的表達(dá)來抵抗細(xì)菌病原體。

圖2. ELENA1敲除與過表達(dá)株系的防御表型

3.ELENA1正調(diào)控elf18誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的基因

為了探究ELENA1在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的作用及其調(diào)節(jié)的基因，使用elf18分別處理野生型和ELENA1過表達(dá)株系0 h、1 h、6 h、12 h后，通過聚類分析、基因本體富集分析，發(fā)現(xiàn)具有系統(tǒng)獲得性抗性、免疫反應(yīng)和防御反應(yīng)相關(guān)的基因顯著富集，表明ELENA1正向調(diào)節(jié)elf18誘導(dǎo)的防御基因。同時(shí)鑒定出了145個(gè)在野生型和過表達(dá)ELENA1植株中表達(dá)水平增加的防御基因，最終通過篩選將PR1、PR2、CRK7、BG3和CYP82C2定為靶標(biāo)基因，通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上基因在ELENA1過表達(dá)株和敲除株中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示以上靶標(biāo)基因在ELENA1過表達(dá)和敲除株中的表達(dá)水平顯示出明顯的負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)了ELENA1正向調(diào)節(jié)對elf18有反應(yīng)的選擇性防御相關(guān)基因的表達(dá)。

圖3. ELENA調(diào)控elf18誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)基因

4.ELENA1與MED19a在體內(nèi)和體外均存在相互作用

為檢驗(yàn)擬南芥中ELENA1與介體亞基之間可能的直接相互作用，作者使用BindN軟件篩選了一組可能具有RNA結(jié)合位點(diǎn)的中介體亞基。隨后利用RNA Pull-Down技術(shù)鑒定與ELENA1結(jié)合的中介體亞基，結(jié)果顯示MED19a與MED26b均能在體外與ELENA1 RNA結(jié)合，同時(shí)利用elf18處理MED19a/MED26b敲除株，發(fā)現(xiàn)只有MED19a敲除株中PR1表達(dá)情況顯示出與ELENA1敲除株系相似的趨勢。進(jìn)一步利用GFP標(biāo)記法、TriFC、RIP實(shí)驗(yàn)證明中介體亞基MED19a與ELENA1在體內(nèi)也存在相互作用。以上結(jié)果說明MED19a是PR1表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子，與ELENA1在體內(nèi)和體外均存在相互作用，并且這種相互作用在elf18處理后得到增強(qiáng)。

圖4. ELENA1與MED19a相互作用

5.ELENA1和MED19a相互作用調(diào)控PR1表達(dá)

為了研究ELENA1、MED19a、PR1表達(dá)間的關(guān)系，作者構(gòu)建了四種不同的ELENA1和MED19a的雙轉(zhuǎn)基因株系分別為35S:ELENA1/med19a-1(E1/m19a)、ELENA1KD-10/UBQ:MED19a(e1#10/M19a)、ELENA1KD-10/med19a-1 (e1#10/m19a)和35S:ELENA1-16/UBQ:MED19a (E1#16/M19a)。使用elf18進(jìn)行處理，通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對不同株系的相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，E1/m19a株系與ELENA1過表達(dá)植物 (E1#16) 相比PR1表達(dá)顯著下降，但略高于med19a-1突變體(m19a)。在ELENA1 KD突變體背景中，MED19a的過表達(dá)(e1#10/M19a)對PR1表達(dá)沒有顯著影響，與e1#10/M19a相比E1#16/M19a株系PR1表達(dá)更高，說明ELENA1和MED19a相互作用進(jìn)一步增強(qiáng)PR1表達(dá)。以上結(jié)果說明在elf18處理下，MED19a對PR1表達(dá)的促進(jìn)作用依賴于ELENA1，但在MED19a之外，還有其他因素與ELENA1相關(guān)聯(lián)以促進(jìn)PR1表達(dá)。

圖5. PR1在ELENA1和MED19a雙突變體中表達(dá)情況

6.ELENA1促進(jìn)MED19a富集于PR1啟動(dòng)子

為了研究ELENA1和MED19a是直接還是間接調(diào)控PR1基因表達(dá)，作者構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因株系PMED19a:GFP-MED19a，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、qPCR定量實(shí)驗(yàn)顯示MED19a富集在含有AS-1類似元素的PR1啟動(dòng)子P4區(qū)域。使用elf18進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)MED19a在PR1啟動(dòng)子上的富集在處理后6小時(shí)達(dá)到最高，在12小時(shí)減少。同時(shí)觀察了突變體中MED19的富集情況，與野生型相比，在ELENA1敲除株系中MED19a在PR1啟動(dòng)子P4區(qū)域的富集大幅減少，而ELENA1過表達(dá)株系中MED19a的富集增加。以上結(jié)果說明ELENA1促進(jìn)了MED19a在PR1啟動(dòng)子上的富集。

圖6. ELENA1促進(jìn)PR1啟動(dòng)子上MED19a的富集

小結(jié)：植物的免疫反應(yīng)是一個(gè)涉及基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜的過程。本文鑒定了擬南芥中一種長非編碼RNA（lncRNA）-ELENA1。ELENA1能夠增強(qiáng)擬南芥對細(xì)菌病原體的抵抗力，其機(jī)制是通過與中介體亞基MED19a相互作用，并影響MED19a在抗病相關(guān)基因PR1啟動(dòng)子上的富集，從而調(diào)控PR1的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了lncRNA在植物先天免疫中的重要作用，為理解植物免疫反應(yīng)的復(fù)雜性提供了新的視角。

藍(lán)景科信技術(shù)簡介

RNA Pull Down

RNA Pull Down是根據(jù)已知的RNA序列，設(shè)計(jì)DNA模版，然后使用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成帶標(biāo)記的RNA探針，并與蛋白提取液進(jìn)行孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。使用鏈霉親和素磁珠純化富集RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，將富集到的蛋白質(zhì)進(jìn)行LC-MS/MS檢測，最終鑒定出與RNA互作的蛋白質(zhì)。

RNA 免疫共沉淀測序（RIP-Seq）

RNA免疫共沉淀測序（RNA Immunoprecipitation Sequencing, RIP-seq）是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)。原理是利用目標(biāo)蛋白的特異性抗體，將對應(yīng)的蛋白-RNA復(fù)合體進(jìn)行免疫沉淀，對分離純化的RNA進(jìn)行建庫與高通量測序。